微生物限度檢查操作

微生物限度檢查操作的若干問題
除微生物制劑外，藥品微生物限度檢查與藥品中有效成分的含量測定顯著不同，其檢查對象具有以下特點：
1 活體易變性
菌細胞在藥品中處于不穩定狀態，可隨存放時間延長死亡，也可在適宜條件下增殖。一批液體制劑若不含防腐劑，它可能是出廠時合格，貯存時不合格，zui終又可能“合格”。當保存條件穩定時，其污染量在一定時間內處于動態平衡，總體污染狀況可以標準化的條件予以正確評估。
2 分布不勻
除產品在生產前期污染外，通常是局部的。一批產品中不同瓶（盒）中污染狀態會出現差異，其污染量特別是致病菌通常是少量的。檢驗樣品的代表性有賴于合理的抽樣方法。
3 多數處于受損傷狀態
藥品中污染的微生物，受到原料處理、加工等過程的影響，或者藥品本身對微生物的抑殺作用，使其受到一定程度的損傷，這些受傷的微生物用一般的方法檢查，往往會出現假陰性或計數偏低的結果。
4 生態環境多樣復雜
污染菌的來源多樣，種類多樣，加之藥品種類繁多、劑型成分復雜，同一種菌在不同的藥劑中所測得的結果各不相同。
微生物限度檢查必須遵循以下原則：
1樣品正式檢驗前必須保持原污染狀態。防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡。
2應有適當的供試液制備方法。供試液的正確制備是保證檢驗結果準確可靠的前提。
3檢驗方法準確可靠
4檢驗結果判斷無誤
作好微生物限度檢驗，檢驗人員的職業品德和業務素質至關重要。
建立科學的質量保證體系，是獲取檢驗結果正確可靠的基本保證。

一、檢驗樣品保持原污染狀態
1 防止再污染無菌技術
設備和無菌操作（略）
2 防止再繁殖或死亡
21 樣品應為未開啟的原包裝、檢驗前保存條件應與藥品貯存條件相同。
22從樣品接觸稀釋劑至接種（注皿）應在1小時內完成，對多批樣品應分段接種（注皿）。
23抑菌性藥品供試液制備，應盡可能縮短制備時間并注意污染微生物的減失（離心、溫度）。

二、供試液制備

1稀釋劑藥典規定使用0.9%無菌氯化鈉及無菌磷酸鹽緩沖液，從保護菌細胞及有利菌細胞的恢復考慮，有必要研究改進。
2量具衡器電子稱藥物天平感量應小于0.1g
容器及吸管現無設備要求誤差小于1％
吸管1ml分度值0.01ml，10ml分度值0.1ml
口徑不大于2mm
3 稱（吸）量固體、半固體10g
液體10ml
膜劑以面積計
分散方式勻漿儀3000～5000rpm，2－4min
4稀釋固體加稀釋劑100ml，液體加稀釋劑90ml，與國外藥典規定有差別。樣品應充分均質或乳化分散在稀釋劑中。對膠囊、膠劑等先打碎再溶解，對栓劑及油劑加適量分散劑，對油膏基質軟膏加適宜乳化劑，如司盤、單硬脂酸甘油酯、吐溫等。
抑菌性樣品：
菌數測定，目前未規定處理方法
控制菌檢查，水溶性樣品：薄膜過濾、稀釋、離心沉淀
混懸液：二次離心
乳濁液：離心法
滅活劑的使用需依品種分別測試
處理時間宜控制在zui短時間內
稀釋方法：吸液在離液面25cm處，放液離第二管液面不高于1cm，管內混和吹打不少于10次，瓶內振蕩混合不少于15s’。

三、方法和結果判斷

目前我國微生物限度檢查在方法標準化、靈敏度、科學性等方面與國外相比還存在一定差距，質量保證體系的建立尚須作許多工作，現就我國現行方法提出一些問題共同討論。
1 菌數測定
我國采用平板稀釋法
11 稀釋度我國現規定稀釋級至少為三級
三級稀釋度的平均菌落生長數互為比照，能較為真實反映藥品中的污染菌量，防止錯誤判斷，對于抑菌性藥品的菌數確定尤其重要。在10-1、10-2稀釋級不生長或少生長而在10－3級平板生長的情況并不少見。
12陰性對照檢查用具、稀釋劑、培養基及檢測環境的本底狀態以確認樣品檢驗的可靠性，是檢驗質量保證的重要步驟。
13培養基培養基的質量是菌數測定的關鍵因素。
培養基注皿量及培養溫度對菌數測定有影響
14點計實際工作中注意細菌、酵母菌及霉菌的區別，細菌與藥渣的區別，霉菌與藥物結晶的區別。
菌落蔓延、重疊、連線生長情況的處理。
不能作為計數依據的幾種情況：三級平板菌落數不能顯示差別；當平板平均菌數＞15時，二個平板菌落數相差1倍以上；平板平均菌落數≤15時二個平板的菌落數不在0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15范圍內。
15報數報數規則的有關問題
細菌數測定報數的舉例：
①、一個稀釋級平均菌落數在30－300時：
10-110-210-3處理原則報告數
13281取10－1320
26448取10－24400
322056繼續稀釋
②、二個稀釋級平均菌落數在30－300時：
10-110-210-3處理原則報告數
1280428比值≤2''取10－210－2平均值3500
230013034比值2''取10－21300
③、三個稀釋級平均菌落數均不在30－300時：
10-110-210-3處理原則報告數
128012037取10－212000
229022040取10－210-3平均值31000
④、各稀釋級平均菌落數均不在30－300時
10-110-210-3處理原則報告數
1多不可計1560342取10－3340000
2310248取10－22400
328124取10-1280
412121
培養基稀釋法
5121
⑤、菌數報告不合理的舉例
10-110-210-3處理原則報告數
1302802010－2／10-1取10－2300
2422908010－3／10-2取10－229000
3322404210－3／10-2取平均值33000
16 復試復試是對菌數結果在合格邊緣的一種處理辦法。
17日常工作中幾種情況的處理：液體制劑發生爆破（或塑瓶膨脹）而常規檢查方法“合格”；相似菌落在二種平板上同時生長；對生長菌落數明顯不符合稀釋分布規律者。
2控制菌檢查
藥品中污染的控制菌數量少、分布不勻，且多受藥物影響呈亞致死狀態，適宜的增菌培養方法和高靈敏度的培養基是提高陽性檢出率的關鍵。
為了保證試驗方法的可靠性，藥典規定的陽性對照與陰性對照試驗是必須的。陽性對照菌須加入供試液中與供試品檢驗同時進行平行試驗。在試驗中，當已知陽性菌不能檢出時，該項控制檢驗結果無效，須認真研究原因，重點考慮藥品的抑菌作用并制定滅活處理方法。
目前藥典規定的陽性對照菌種，多為具有毒力的致病菌如乙型副傷寒沙門氏菌，破傷風梭菌等，為防止試驗中污染供試品檢驗環境，作陽性菌對照試驗時應與供試品檢驗分開進行，使用操作間或接種臺。
（1）大腸桿菌檢查（略）
（2）沙門氏菌檢查
① 增菌培養預增菌營養肉湯
增菌四硫磺酸鹽煌綠肉湯
沙門菌在增菌培養液中呈均勻混濁、無菌膜、無沉淀。
② 分離培養DHL''SS;EMB''MacC
疑似菌落為透明或半透明，無色（或微顯培養基色）
在含H2S指示系統培養基上菌落中心呈黑色
發酵乳糖的亞屬Ⅲ其菌落呈乳糖指示系統顏色
③ 初步鑒別疑似培養物在TSI上為K/AH2S＋，K/AH2S－，A/AH2S＋
④生化反應
H2S賴氨酸脫羧酶靛基質脲酶
沙門菌屬反應＋＋--－
＋＋＋少見--
－＋--－
⑤血清凝集試驗直接凝集試驗＋
或煮沸30分鐘后凝集試驗＋
⑥結果判斷革蘭氏陰性桿菌④及⑤兩項均符合報告檢出沙門菌
當④及⑤兩項中一項不符合時進一步檢驗
當④及⑤兩項均不符合時報告未檢出沙門菌
（3）金黃色葡萄球菌檢查
① 增菌培養營養肉湯、亞碲酸鈉肉湯，均勻混濁，稍有沉淀
② 分離培養卵黃氯化鈉平板，甘露醇氯化鈉平板，血平板
疑似菌落金黃色、圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，有乳濁圈（卵黃氯化鈉平板），黃色環（甘露醇氯化鈉平板）、透明溶血環（血平板）
③ 生化試驗及染色血漿凝固酶試驗陽性
G＋球菌
④ 結果血漿凝固酶試驗陽性，G＋球菌，報告陽性檢驗結果
（4）銅綠假單胞菌
增菌培養膽鹽乳糖培養基液體表層生長旺盛、有菌膜
分離培養溴代十六烷*胺平板
疑似菌落灰白色扁平、圓或無定形，邊緣不齊，周邊呈擴散現象，典型者菌落周圍呈藍綠色。
生化試驗及染色G－桿菌
①氧化酶試驗＋
②綠膿菌素試驗＋
③硝酸鹽還原產氣試驗＋
④明膠液化試驗＋
⑤41℃生長試驗＋
結果G－桿菌①及②陽性作出陽性結果報告
G－桿菌①陽性②陰性
則③、④、⑤皆為陽性作出陽性結果報告
（5）破傷風梭菌檢查
為厭氧梭菌，須以厭氧培養法檢查
厭氧培養方法冷觸媒法
焦性沒食子酸法
增菌產毒培養產氣、臭味、肉渣消化
染色鏡檢典型者為鼓槌樣芽孢桿菌
毒力試驗當增菌產毒培養出現疑似培養物時須作毒力試驗，當染色鏡檢發現疑似破傷風梭菌者，*次毒力試驗陰性時應連續進行二次增菌產毒培養，并接種新霉素血平板，刮取疑似菌作增菌產毒培養。
結果毒力試驗陽性，不論鏡檢是否發現疑似破傷風梭菌，均作出陽性檢驗報告

平板細菌菌落計數置信區間

菌落總數 平均值 標準差 95％置信區間 99置信區間 范圍
   下限   上限  下限  上限 
1 05000 05000 0013 1844 0003 2639 
2 10000 07071 0121 2786 0052 3715 
3 15000 08660 0309 3612 0169 4637 0-4
4 20000 10000 0545 4384 0336 5489 
5 25000 11180 0812 5127 0539 6297 
6 30000 12247 1101 5834 0768 7075 
7 35000 13229 1407 6530 1019 7830 1-7
8 40000 14142 1727 7211 1286 8567 
9 45000 15000 2058 7882 1566 9289 
10 50000 15811 2398 8542 1858 9999 2-9
11 55000 16583 2746 9195 2161 10699 
12 60000 17321 3100 9841 2472 11390 
13 65000 18028 3461 10481 2790 12072 3-10
14 70000 18708 3827 11115 3115 12748 
15 75000 19365 4198 11745 3447 13410 4-12
16 80000 20000 4573 12370 3783 14082 
17 85000 20616 4952 12992 4125 14741 
18 90000 21213 5334 13609 4472 15395 5-14
19 95000 21794 5720 14224 4822 16045 
20 100000 22361 6108 14835 5177 16691 6-15
21 105000 22913 6500 15444 5535 17334 
22 110000 23452 6894 16050 5896 17973 
23 115000 23970 7290 16654 6260 18609 7-17
24 120000 24495 7689 17256 6628 19242 
25 125000 25000 8089 17855 6998 19873 8-18
26 130000 25495 8492 18452 7370 20509 
27 135000 25981 8897 19040 7745 21125 9-19
28 140000 26458 9303 19642 78123 21740 
29 145000 26926 9711 20234 8052 22369 10-20
30 150000 27386 10120 20824 8884 22983